Trong khi tuyển diễn viên cho Glee, Murphy muốn tìm kiếm một nam diễn viên thể hiện được tâm huyết của nhân vật. Thay vì tổ chức một buổi tuyển diễn viên, anh lại giành ba tháng tại Broadway, nơi anh tìm được Matthew Morrison, người xuất hiện trong vở kịch Hairspray và The Light in the Piazza; Lea Michele, người xuất hiện trong Spring Awakening; và Jenna Ushkowitz, người xuất hiện trong phiên bản mới của vở kịch The King and I.[36]

Anh đồng thời cũng tuyển chọn những nam diễn viên dù không có kinh nghiệm như có thể hát, nhảy và diễn tốt. Chris Colfer cũng vậy, nhưng Murphy đã viết một nhân vật nữa trong bộ phim để dành cho anh.[36] Jayma Mays cũng đã tham gia buổi tuyển chọn với ca khúc "Touch-a, Touch-a, Touch-a, Touch Me" trong The Rocky Horror Show. Trong khi đó, Cory Monteith chỉ gửi cho họ một cuốn phim mà anh diễn xuất, nhưng chỉ trong vòng vài giây, anh đã được nhận một yêu cầu gửi một đoạn băng thể hiện tài năng trình diễn của mình. Trong đoạn băng ấy, anh đã hát "phiên bản tầm thường của video ca nhạc thập niên 80" "Can't Fight This Feeling" do REO Speedwagon trình bày.[36] Kevin McHale đến từ một nhóm nhạc bè nam, họ từng là một phần của ban nhạc Not Like Them. Anh giải thích về sự đa dạng về thể loại của nhóm nhạc cũng như tính nhạc trong bộ phim: "Đó chính là sự hòa trộn giữa nhiều thể loại khác nhau: rock cổ điển, những thứ hiện đại, R&B. Kể cả những bản nhạc kịch cũng được tái tạo lại. Và bạn sẽ không bao giờ nhận ra nó."[36] Jane Lynch ban đầu chỉ định nhận một vai phụ trong bộ phim,[37] nhưng sau đó đã trở thành vai chính khi tập phim mở đầu của Damon Wayans cho kênh ABC.[38] Sau đó, dàn diễn viên của bộ phim đã ký hợp đồng để xuất hiện trong ba bộ phim điện ảnh của Glee[39] với điều khoản là "[Diễn viên] phải thực hiện ba bộ phim điện ảnh độc quyền cho kênh Fox, [diễn viên] không thể thay đổi hợp đồng sau khi đã ký." Dù vậy, đến nay, chưa có một bộ phim điện ảnh nào được lên kế hoạch sản xuất.[40]

Glee gồm 12 diễn viên chính. Morrison thủ vai Will Schuester, thầy giáo Tây Ban Nha của trường McKinley High và là người sáng lập đội hát của trường với hi vọng có thể giúp nhóm trở nên thành công như những ngày tháng từng hoạt động.[23] Lynch thủ vai Sue Sylvester, huấn luyện viên của đội cổ vũ "Cheerios" và luôn tìm cách để phá hoại đội hát.[38] Mays thủ vai Emma Pillsbury, là một giáo viên tâm lý bị hội chứng mysophobia (ám ảnh dơ bẩn) nhưng lại có tình cảm với Will,[41] và Jessalyn Gilsig thủ vai Terri Schuester, vợ cũ của Will, người đã bị Will ly hôn vì cô đã giả vờ mang bầu.[42] Lea Michele thủ vai Rachel Berry, một ngôi sao tài năng của đội nhưng bị nhóm cổ vũ và đội bóng bầu dục bắt nạt.[42] Monteith thủ vai Finn Hudson, ngôi sao tiền đạo của đội bóng bầu dục và là người bị bạn bè trêu chọc từ khi tham gia vào đội hát.[42] Trong nhóm còn có Amber Riley trong vai Mercedes Jones, một diva da màu thời trang người thường xuyên phải đảm nhiệm vai trò hát bè; Colfer trong vai Kurt Hummel—một anh chàng đồng tính với kiểu giọng countertenor;[43] McHale trong vai Artie Abrams, một chàng trai thường xuyên chơi guitar và bị liệt ở chân; và Ushkowitz trong vai Tina Cohen-Chang, một học sinh người Mỹ gốc Á và có khả năng giả tật nói. Mark Salling trong vai Noah "Puck" Puckerman, một người bạn thân của Finn trong đội bóng và là người đầu tiên phát hiện ra cậu tham gia đội hát. Nhưng sau đó, cậu cũng đã tự nguyện tham gia vào đội. Dianna Agron trong vai Quinn Fabray, đội trưởng của đội cổ vũ và là bạn gái của Finn, người sau đó cũng đã gia nhập vào đội hát. Naya Rivera và Heather Morris trong vai Santana Lopez và Brittany Pierce, họ đều là thành viên của đội hát và đội cổ vũ. Trong mùa một, họ đã được chọn làm hai diễn viên phụ, cho đến mùa hai, hai người đều xuất hiện trong danh sách những diễn viên chính của bộ phim.[44] Mike O'Malley, người thủ vai cha của Kurt, Burt Hummel, đồng thời cũng là nhân vật chính vào mùa hai.[45]

Trong một buổi phỏng vấn với Ryan Seacrest vào tháng 6 năm 2011, Ryan Murphy đã tuyên bố rằng những thành viên của đội hát sẽ tốt nghiệp tại trường McKinley High vào mùa ba. Còn hai nhân vật chính là Matthew Morrison và Jane Lynch sẽ tiếp tục dẫn dắt câu chuyện.[46]